УДК 612.112.95:616.157] - 612.014.44
Жураковский И.П., Битхаева М.В., Архипов С.А.
Пустоветова М.Г., Кунц Т.А., Маринкин И.О.
ЗАВИСИМОСТЬ ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРА МОНОЦИТОВ/МАКРОФАГОВ И МАРКЕРА АКТИВАЦИИ КЛЕТОК В ПЕЧЕНИ КРЫС ОТ УРОВНЯ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПРИ ПЕРСИСТЕНЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ФОНЕ КРУГЛОСУТОЧНОГО СВЕТОВОГО ОСВЕЩЕНИЯ
Центральная научно-исследовательская лаборатория ГБОУ ВПО НГМУ
It was revealed that monocytes/macrophages marker (clone 1C7 – CD68 differential cluster prototype) expression and CD25 activation marker expression in Wistar rat liver depend on cytokines (IL-1β, IL-1β RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-g) level in blood serum at persisting bacterial infection caused by Staphylococcus aureus (strain 209) against round-the-clock illumination.
Key words: bacterial infection, Staphylococcus aureus, apoptosis markers, CD25, clone 1C7, cytokines, round-the-clock illumination.
Выявлена зависимость экспрессии маркера моноцитов/макрофагов (клон 1C7 – аналог кластера дифференцировки CD68) и активационного маркера CD25 в печени крыс Wistar от уровня цитокинов (IL-1β, IL-1β RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-g) в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции, вызванной Золотистым стафилококком (штамм 209) на фоне круглосуточного освещения.
Ключевые слова: бактериальная инфекция, Золотистый стафилококк, CD25, клон 1C7, цитокины, круглосуточное освещение.
Современные условия техногенной цивилизации способствуют широкому распространению воспалительных заболеваний. Многие исследователи связывают высокую частоту хронических заболеваний различных органов и систем с воздействием неблагоприятных экологических факторов, несвоевременным и неадекватным лечением острых инфекционно-воспалительных процессов, развивающихся на фоне несовершенного иммунного ответа на этиологический фактор [1-3].
Длительное существование фокальной персистирующей инфекции вызывает определенное изменение функционирования основных гомеостатических систем, и, как следствие, структурную перестройку органов и тканей. Описан синдром сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе, основным составляющим которого является реакция соединительной ткани [4;5].
Имеются работы, в которых отмечается зависимость экспрессии маркеров макрофагов/моноцитов в печени крыс Wistar от уровня цитокинов в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции [6]. Вместе с тем взаимосвязи между макрофагальной системой печени и изменениями цитокинового профиля до конца остаются еще не изученными. Особенный интерес, в этой связи, представляет изучение особенностей течения хронического воспалительного процесса на фоне воздействия различных дополнительных дестабилизирующих факторов, одним из которых является световой десинхроноз.
Целью настоящего исследования являлось выявление зависимости экспрессии маркеров макрофагов/моноцитов в печени крыс Wistar от уровня цитокинов в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции на фоне круглосуточного освещения.
Проведена оценка клеток системы мононуклеарных фагоцитов в печени, а также уровня цитокинов (IL-1β, IL-1β RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-g) в сыворотке крови 12 самцов крыс Вистар при воспроизведении у них с помощью Золотистого стафилококка (штамм 209) остеомиелита большеберцовой кости. Световой десинхроноз вызывали содержанием крыс при круглосуточном освещении в течение 2 недель через 1,5 месяца после момента инфицирования. Животных выводили из эксперимента через 2 и 3 месяца с момента воспроизведения модели. В качестве контроля использовали 6 интактных животных. Для оценки пула всех клеток системы мононуклеарных фагоцитов в печени, в том числе моноцитов, использовали моноклональные антимакрофагальные антитела к антигену, который экспрессируется на мембранах большинства моноцитов/макрофагов (клон 1C7 – аналог кластера дифференцировки CD68). Для выявления пула иммунокомпетентных активированных клеток использовали антитела к кластеру дифференцировки CD25. Количественный анализ площади, на которой выявлялась экспрессия маркеров, проводилась с помощью морфометрического комплекса на базе микроскопа Micros MC 300A, цифровой камеры CX 13c фирмы Baumer и программного обеспечения ImageJ 1.42g. Определяли площадь, занимаемую клеточными элементами экспрессирующих изучаемые маркеры (sобл), среднее серое значение яркости площади, занимаемой клеточными элементами экспрессирующих изучаемые маркеры (rобл), среднее серое значение яркости фона (rфона). На основании этих данных вычислялись: 1) интенсивность окраски фона (ioфона) по формуле ioфона = 255 - rфона; 2) интенсивность окраски области, занимаемой клеточными элементами экспрессирующих изучаемые маркеры (ioобл), по формуле ioобл = 255 - rобл - ioфона; 3) экспрессия маркера (e) по формуле e = sобл х ioобл. Исследование цитокинового профиля проводилось наборами реагентов для иммуноферментного определения концентрации (IL-1β, IL-1β RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-g) в сыворотке крови - производства ЗАО «Вектор Бест» (г.Новосибирск) с использованием Wellwasf 4 Mk2 фирмы Thermo scientific (Finland) и спектрофотометра Multiscan Spectrum фирмы Thermo scientific (Finland).
Через 2 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции, на фоне светового десинхроноза, при оценке экспрессии антигена, который выявляется на мембранах большинства моноцитов/макрофагов (клон 1С7), было выявлено достоверное увеличение интенсивности специфического окрашивания. Экспрессия данного маркера в образцах печени была выше, чем в контрольной группе. Вместе с тем площадь, занимаемая клеточными элементами, в которых выявлялся данный маркер, достоверно не отличалась от аналогичного показателя у интактных животных. Анализ экспрессии маркера активации CD25 показал, что воздействие персистенции бактериальной инфекции на фоне светового десинхроноза приводит к достоверном увеличению пула активированных мононуклеарных клеток в печени.
Изучение профиля цитокинов позволило выявить статистически значимое повышение провоспалительного (IL-6) и противовоспалительнного (IL-4) компонентов иммунной защиты. При поведении корреляционного анализа были получены результаты, указывающие на существование высоко значимых: а) положительной зависимости между интенсивностью окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих клон 1С7, и концентрациями IL-4 и IL-18 в сыворотке крови; б) положительной зависимости между площадью, занимаемой клеточными элементами, экспрессирующих маркер активации CD25, и концентрациями IL-4 и IL-18 в сыворотке крови животных этой группы.
При оценке экспрессии антигена, который экспрессируется на мембранах большинства моноцитов/макрофагов (клон 1С7) через 3 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции, на фоне восстановления хронобиологического ритма у животных, было выявлено дальнейшее нарастание интенсивности специфического окрашивания. Экспрессия данного маркера в образцах печени сохранялась выше, чем в контрольной группе. Вместе с тем площадь, занимаемая клеточными элементами, в которых выявлялся данный маркер, достоверно не изменялась по сравнению с аналогичным показателем интактных животных. Анализ экспрессии маркера активации CD25 показал, что воздействие персистенции бактериальной инфекции в восстановительном периоде после спровоцированного светового десинхроноза приводит к дальнейшему увеличению пула активированных мононуклеарных клеток в печени.
Изучение профиля цитокинов позволило выявить статистически значимое повышение провоспалительных (IL-6, IL-18, TNF-a) и противовоспалительных (IL-1β RA, IL-10, IL-17) компонентов иммунной защиты. При поведении корреляционного анализа были получены результаты, указывающие на существование высоко значимой отрицательной зависимости между концентрациями IL-6, IL-17 и интенсивностью окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих клон 1С7; высоко значимой отрицательной зависимости между концентрацией IL-1β RA и экспрессией клона 1С7 в макрофагах печени. Были отмечены высоко значимые: прямая зависимость между экспрессией CD25 и концентрацией TNF-a; и обратная зависимость между экспрессией CD25 и концентрацией IL-2 в сыворотке крови крыс через 3 месяца после инфицирования животных. Кроме того, были выявлены высоко значимые: прямая зависимость между интенсивностью окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих CD25, и концентрацией IL-2; обратная зависимость между интенсивностью окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих CD25, и концентрацией IL-1β в сыворотке крови животных этой группы.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о неоднозначной направленности реакции иммунной системы в условиях персистенции бактериальной инфекции на фоне светового десинхроноза: происходит динамическая балансировка между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами, осуществляющими взаимодействие с системой мононуклеарных фагоцитов печени. Процесс активации клеток Купфера, ведущий, через активацию звездчатых клеток печени, к развитию фиброза, зависит от уровня «цитокиновой среды», в которой часто меняющиеся сигналы носят сложный характер из-за большого разнообразия цитокиновых рецепторов и из-за того, что каждый цитокин может активировать или подавлять несколько процессов, включая свой собственный синтез и синтез других цитокинов.
1. Пекарева Н.А., Трунова Л.А., Белоусова Т.В., и др. К вопросу об активности иммуновоспалительного процесса у детей с хроническим пиелонефритом в стадии клинической ремиссии / Бюллетень СО РАМН, №3 (131), 2008.- с.52-55.
2. Бухарин О.В. Значение персистенции бактериальных патогенов для клинической практики / Российские медицинские вести, №3, т V, 2000.- с. 18-25.
3. Карпин В.А. Общая теория патологии: хронический инфекционный процесс / Успехи современного естествознания, № 4, 2005.- с 17-20.
4. Команденко Н.И., Жураковский И.П., Рыжов А.И. Синдром сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений в производных мезенхимы при воздействии фокальной персистирующей инфекции. Свидетельство об интеллектуальной собственности, зарегистрированное ВНТИЦ 07.08.2002г. №72200200029.
5. Команденко Н.И., Рыжов А.И., Жураковский И.П. Остеохондроз позвоночника: Монография.- Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ, 2006.- 246с.
6. Жураковский И. П., Битхаева М.В., Архипов С.А., и др. Зависимость экспрессии маркеров моноцитов/макрофагов в печени крыс от уровня цитокинов в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции / Сборник научных трудов SWorld по материалам международной научно-практической конференции «Научные исследования и их практическое применение. Современное состояние и пути развития 2011». – Т.28.- Одесса, 2011.- С. 6-9.